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    Varioskan 多功能酶標(biāo)儀助力浙江理工大學(xué)研究團隊發(fā)現(xiàn)Nf2-FAK信號軸在顱骨缺損再生中的治療潛力

    顱骨作為高度精密調(diào)控的組織,其發(fā)育與再生過程受嚴(yán)格分子調(diào)控。顱骨干細(xì)胞的命運決定及向成骨細(xì)胞譜系的定向分化,對顱骨正常發(fā)育與損傷修復(fù)至關(guān)重要。然而,顱骨干細(xì)胞如何精確調(diào)控顱骨發(fā)育與再生的分子機制,一直是科學(xué)界亟待解決的關(guān)鍵問題。


    2025年3月12日,浙江理工大學(xué)陳貴錢課題組在國際權(quán)威期刊《自然-通訊》Nature Communications,影響因子14.7)發(fā)表題為“Nf2-FAK signaling axis is critical for cranial bone ossification and regeneration”的重要研究成果。該研究揭示Nf2-FAK信號軸在顱骨干細(xì)胞命運決定及顱骨發(fā)育與再生中的核心調(diào)控作用。


    研究團隊通過高通量測序篩選新靶點,結(jié)合條件性基因敲除小鼠模型,發(fā)現(xiàn)Nf2基因在顱骨組織中特異性高表達。課題組通過構(gòu)建顱骨缺損小鼠模型,結(jié)合誘導(dǎo)性基因敲除和R26-Tomato細(xì)胞示蹤技術(shù),發(fā)現(xiàn)Nf2缺失顯著延緩顱骨缺損再生進程,并抑制遷移至損傷部位的顱縫干細(xì)胞的增殖潛能。接著做了體外細(xì)胞實驗,通過慢病毒過表達、Co-IP及NanoBiT活細(xì)胞蛋白互作實驗,證實Nf2作為FAK的上游調(diào)控因子,與其直接互作,并通過PI3K/Akt和Erk1/2信號通路調(diào)控細(xì)胞功能。


    這一研究揭示了Nf2-FAK信號軸在骨發(fā)育與再生中的核心調(diào)控作用,為顱骨缺損再生的臨床干預(yù)提供了新靶點和新策略,具有重要的臨床轉(zhuǎn)化潛力。



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    Part.

    01


    文中,研究者用NanoBRET?Nano-Glo?Detection System 試劑盒定量評估 Nf2 和 FAK 在活細(xì)胞中的動態(tài)相互作用。NanoBRET?系統(tǒng)是一種生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移,它是基于蛋白接近度的檢測技術(shù),通過測量從生物發(fā)光蛋白供體至熒光蛋白受體的能量轉(zhuǎn)移來檢測蛋白間的相互作用。如圖1所示,Large BiT(LgBiT;17.6kDa)和 Small BiT(SmBiT;11 個氨基酸)亞基分別與目的蛋白融合,當(dāng)A蛋白表達時,蛋白相互作用會使這兩種亞基極為靠近從而發(fā)出明亮發(fā)光信號。


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    圖1


    Part.

    02


    信號檢測采用Varioskan LUX (Thermofisher),配備有適當(dāng)濾光片的能夠依次測量雙濾光片發(fā)光檢測功能,使用以下設(shè)置:


    總測量時間:1000ms

    測量供體信號濾光片:發(fā)射波長 450nm/BP 80nm

    測量受體信號濾光片:發(fā)射波長 610nm/LP


    結(jié)果表明,在小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1中,Nf2-C末端小亞基結(jié)構(gòu)域與FAK-N末端的大亞基結(jié)構(gòu)域相互作用。且Nf2-FAK的生物發(fā)光率約為陰性對照組的37.6倍,明顯大于活性蛋白的定義:蛋白質(zhì)相互作用閾值(約10倍)(p=0.0001,n=3)(圖2)。


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    圖2


    Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀








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    Thermo Scientific? Varioskan? LUX 多功能酶標(biāo)儀可實現(xiàn)多種測定,包括吸光度測定、熒光強度測定、化學(xué)發(fā)光測定、AlphaScreen 測定和時間分辨熒光測定技術(shù),專為滿足生物科學(xué)研究人員的各種需求而設(shè)計。該儀器具備智能化的自動增益條件功能,簡化了測量時的設(shè)置,其智能安全控件簡化了工作流程并且有助于避免實驗誤差。Varioskan LUX 提高了多功能酶標(biāo)儀可靠性和易用性標(biāo)準(zhǔn),最大限度的滿足了研究人員的需要。


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